El principi de treball del microscopi estèreo es basa en la visió estèreo binocular, que proporciona un mètode d’observació tridimensional a través de dues vies òptiques independents.
El nucli del microscopi estèreo rau en el seu disseny de l'estructura òptica, que sol contenir una lent d'objectiu primari comú. Els dos feixos de llum després de la imatge de l'objecte estan separats per dos conjunts de lents objectives intermèdies (també anomenades grups de lents de zoom) i formen un cert angle (generalment de 12 a 15 graus) i, a continuació, formen imatges a través dels seus respectius oculars. Aquest disseny fa que les imatges es vegin per l’ull esquerre i l’ull dret lleugerament diferent, i el cervell fusiona aquestes imatges per reconstruir el sentit tridimensional de l’objecte.
